VIGS 操作基本方法

Grow cotton seedlings

1.       将种子提前3天催芽（建议催芽抹布用开水浸泡洗净，催芽过程中种子不可浸泡在水里，确保抹布湿润即可，期间2-3次补水以保证萌发率），提前1天拌土（建议蛭石：营养土=1：4，完全浸润后多余的水倒出，种子点播于营养钵育苗盘中。

2.       将育苗盘放于培养室中，覆盖透明塑料膜， 保持温度25℃， 光照120μEM，16h光照，8h黑暗，3-4天后揭膜。

3.       待幼苗长至第10天左右，此时子叶已完全平展，真叶未展开，植株用于VIGS分析。

Perform VIGS inoculation

1. 接种前2天的晚上，把保存于－80℃的农杆菌菌株 pTRV1（据需求调整活化量）、pTRV2、pTRV-Gene、 CLA活化。20μL 菌液加入 1 ml LB （50 μg/ml Kan⁺, 25 μg/ml Rif） 于2 ml 离心管中培养，28℃ 200rpm 过夜

2. 接种前 1 天晚上，接大样。将活化后的菌株加入 10ml LB于50ml锥形瓶，28℃ 200rpm 16h左右。

3. 约16 h 后，农杆菌液 OD₆₀₀＝？左右，将菌液收集于10ml离心管中，4000rpm 离心 15分钟。 去上清，用重悬液调整浓度OD600＝1.0 （这只是个参考，建议最高不要超过1.2

不低于0.6）. infiltration buffer (10mM MgCl2,10mM MES, 150uM AS）将重悬液 pTRV1 分别与 pTRV2,pTRV-Gene，CLA 按1：1等量混合均匀。

4. 将混合后的菌液在常温放置3h或28℃ 200rpm 摇1h。

5. 用枪头在棉花幼苗子叶背面扎几个小孔，用2 ml注射器将混合后的菌液延着小孔注射入棉花子叶。（注射后的棉花子呈浸水状，尽量保证两片子叶充分注入农杆菌）

6. 将注射后的棉花植株用黑色塑料布遮盖，避光培养24 h。

7.揭开黑布，保持培养条件为25℃，光照120 μEM。

8. 一般注射两周后，棉花植株可用于取样做基因表达分析及进行后续实验处理。