以下只是介绍双靶点的敲除系统的构建方法，如需要多靶点敲除，选择酶切位点组合添加多个U6-sgRNA即可。

Gene Knockout Mediated by CRISPR-Cas9 System

(Cas9-2hitKO)

CRISPR-Cas9系统简介：

图1. CRISPR-Cas9 系统介绍

CRISPR-Cas9 系统是一种被广泛运用基因组编辑工具，它来源于细菌的适应性免疫系统。CRISPR-Cas9系统包括：Cas9酶 和一个向导 RNA。 向导RNA 作用是引导 cas9 到基因组的特异性位点上切割。如图1所示。目前为止，CRISPR-Cas9 系统主要有两方面应用: 基因敲除和基因敲入。基因敲除时, 一旦DNA的双链断裂反应（DSB）被Cas9切割诱导发生, 细胞会启动 NHEJ DNA修复方式，这会造成DNA的删除和插入。对于基因敲入，加入一个可同源重组的DNA片段, 细胞会将这个一段DNA片段插入进基因组 。

两次或者三次切割介导的基因敲除

与先前的敲除策略并不一样，我们改进的这个操作系统可以将基因的删除做到可控的特定长度。我们正在基因组的一个特定的区域引入两个或者三个sgRNA。这些sgRNA指引Cas9酶在这两个位点进行切割。然后切割后末端通过 NHEJ连接上。通过这个策略，我们可以将一个基因的独立外显子或者整个基因敲除掉。如图2所示。

图2.  Cas9-2hitKO系统

图3.  Cas9-3hitKO系统

Cas9-2hitKO系统中涉及到载体

图4. PX458M图谱

图5. PX459M图谱

      PX458M和PX459M 载体是从张峰实验室 PX458 and PX459 载体改造过来的。主要是引入36个碱基的多克隆位点（详细序列见pX458M和pX459M网页）。PX458M 带有 EGFP 荧光标记; PX459M带有 puromycin 抗性筛选标记。

图6.中间质粒pHH-hU6-A-gRNA图谱

图7.中间质粒pHH-hU6-B-gRNA图谱

过渡载体由addgene #53188 phU6-gRNA，在“hU6-gRNA scaffold”两侧添加酶切位点改造而来，用酶切整个“hU6-sgRNA-gRNA scaffold”,可用于多靶点CRISPR 敲除系统，也可以单独用于表达sgRNA。

Guide RNA插入

根据张峰实验的实验操作方法， guide RNA 插入方法很简单。如图6所示，可以用 BbsI消化PX458M或者PX459M载体, Guide RNA是通过引物退火方法(20 bp 长)引入的BbsI粘性末端通过T4 DNA连接酶插入到载体中。

图8.向导性 RNA插入方法

实验流程

       I.           设计脱靶效应低Guide RNA序列

基于网站的GuideRNA的设计

     网站地址：http://crispr.mit.edu/. 基本的流程如下图。

1.      输入最多250个核苷酸的基因组 DNA序列进 图7的Sequence框中 选择相应的物种。点击‘submit’。

2.      点击‘Guides & offtargets’.

图9. Guide RNA 设计流程

II.           选择一对GuideRNA来敲除基因

敲除基因组一段序列，选择一对 Guide RNA就显得非常重要。根据前人的实验，敲除基因 1M b并没什么问题。我们一般建议敲除10Kb以下。 选择一对Guide RNA的标准如下, 

a.      如果目的基因比较短，在10kb 左右 ，建议敲除全基因，甚至包括启动子。

b.      如果目的基因比较长，建议敲除比较重要的外显子。

c.       目的基因比较长，也可以敲除全部的启动子和部分的基因编码区

d.      如果目的基因在发表的文献中已经报导过用传统方法敲除，我们可以用这套系统敲除同样区域。

III.           构建双Guide RNA克隆

1.      合成引物.

前向引物： CACC-(N)20

方向引物: AAAC-(N)20R

如果根据张峰网站设计的Guide RNA第一个核苷酸不是‘G’,在5’端补加一个  ‘G’，因此设计好引物变成：

前向引物: CACC-G(N)20

反向引物: AAAC-(N)20RC

2.      引物磷酸化与退火

95℃ 5min，自然降温到室温(或者用PCR梯度降温)。

将载体酶切尽可能保证载体全部双酶切切开，可以选择NEB没有星活性的的酶。

取1ul 退火后的溶液，与载体（20-50ng就够了）连接并转化。

3.      Px458M(或 PX459M) 和pHH-hU6-gRNA载体的 BbsI酶消化

割胶回收载体，回收后的载体浓度应大于50 ng/ul。

4.      连接反应

16 ℃连接过夜

5.      转化和鉴定阳性克隆

 转化后挑取单克隆LB培养，然后PCR鉴定克隆。Px458M 或Px459M载体 用hU6测序。而pHH-hU6-gRNA, 用 M13F /R作为鉴定引物测序。

6.      将Guide RNA2 从pHH-hU6-gRNA转入到Px458M /Px459M-Guide RNA1得到插入双Guide RNA的载体Px458M /Px459M-Guide RNA1-Guide RNA2(以pHH-hU6-A-gRNA为例，也可以选用A的其他酶切位点，或者不同酶切位点的pHH-hU6-B-gRNA)

7.      割胶回收

pHH-hU6-gRNARNA2消化后割取 460 bps条带回收; PX458M/PX459M-Guide RNA1,  割取9300bps大小的条带。

8.      连接反应

       16 ℃过夜连接。

 IV.           如果是敲人源细胞中的基因，我们可以在293FT细胞检测 系统的敲除效率，小鼠的细胞中的基因可以在MEF和NIH3T3中检测系统的敲除效率

1.        将上述Px458M /Px459M-Guide RNA1-Guide RNA2转染进293FT细胞中

36-48 小时

2.        通过荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率

3．提取转染细胞基因组，进行基因型鉴定。引物的设计方案如图11所示。图12显示敲除 PPM1A 基因。

        V.           敲除自己感兴趣的细胞中的基因

理论中，只要转染进Px458M /Px459M-Guide RNA1-Guide RNA2载体的细胞就是基因敲出的细胞，然而我们想得到纯的基因敲除细胞株需要进行细胞单克隆化培养。对于一些细胞，单克隆化培养并不是那么容易。为了增加单个细胞的扩增，我们可以预先包被gelatin和条件性诱导培养液。

1.      细胞提前一天铺在6孔板中，确保细胞密度在70%-80%。

2.      Px459M-Guide RNA1-Guide RNA2转染自己感兴趣的细胞并培养24 小时。

3.      用puromycin连续筛选3到4 天。 以没有转染的细胞做对照。

 注意!: 每种细胞筛选的puromycin并不完全一样，应该通过梯度实验摸索最佳浓度

4.      撤销 puromycin, 用 20% FBS培养液培养细胞。

5.      几天后，如果有克隆发生增殖了，挑取克隆，并转移到24孔板中继续培养。剩下的细胞也可继续培养。

6.      24孔板中细胞达到 30%密度, 胰酶消化细胞，取出 80% 细胞来做基因型鉴定, 20% 细胞继续培养。

7.       14000rpm离心收取细胞30s。加入 20-60ul solution A裂解细胞。95 ℃加热10 min,然后加入同样体积的 solution B, 涡旋震荡一下, 13000rpm 离心0min。取上清做基因型鉴定的模板。

8.      做完基因型鉴定后，只继续培养基因敲除的细胞克隆。

9.      当基因敲除的细胞克隆长满时，胰酶消化，进行细胞计数。以40个细胞每10毫升进行10倍梯度稀释。

10.  第9 步中培养液也就是条件刺激培养液，也就是收集第9步中培养时间少于24小时的旧的培养基，在这样的培养基中加入20% FBS 后用 0.22 ul 滤膜过滤后的细胞培养液称为条件刺激培养液。

11.  在96孔中，每孔加入100 ul 除菌的0.1% gelatin溶液, 在37 ℃ 细胞培养箱中放置30分钟以上。

12.  吸去 gelatin,条件刺激的细胞培养液重悬细胞，按每孔100 ul，大约 0.4 cell 加入到96孔每个孔中。加入8 到10 个孔。摇匀继续培养。

13.  4到5天后在上述孔中继续加入条件刺激培养液100 ul每孔，不要超过5天。

14.  当细胞密度超过 30%, 或者克隆长得足够大，将它转移到24孔板中继续培养。 重复6-8步。

15.  步骤5中剩余的细胞长到50% 密度时,继续有限稀释进行单克隆化培养。也可以冻存起来留置后用。

     VI.           评估脱靶效应

脱靶的情况在网址 (http://crispr.mit.edu/.) 上评估。这个网站上列举上很多潜在的脱靶位点。把这些位点通过PCR的方法扩增出来进行PCR产物测序。如果没有发现建立好基因敲除细胞株有明显的脱靶情况，那么这样的细胞可以用来进行后续的实验。