双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞)

上海海吉浩格生物科技有限公司

1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理图

2 相关载体图谱

2.1 中间载体 ，sgRNA载体（预设有BbsI酶切位点）

中间载体

2.2 CRISPR/Cas9骨架载体，表达CAS9，同时有完整的sgRNA表达框

含有CAS9的骨架载体

（骨架载体可以换成PX459、PX461，PX462、lenticrispr V2、lentiguide-puro或者其他同种gRNA scaffold的质粒）

3. 基因组靶位点选择和双链接头设计

3.1 靶位点选择

根据目的基因的物种在sgRNA设计网站上是设计靶点序列，根据需要选择特异性好的两个sgRNA靶点序列。

注（20nt靶点中F和R是为了标记序列方向的碱基，F--R为正向，R--F为反向互补;N和M都代表任意碱基，本文N20代表sgRNA1，M20代表sgRNA2）

对一个目的基因设计2个靶点。建议在ORF 5’区和功能结构域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。

3.2引物设计

PCR产物核心公共序列

gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG

PCR扩增后的序列

GaagacaccaccG-FNNNNNNNNNNNNNNNNNNR-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG-FMMMMMMMMMMMMMMMMMMR-gtttaggtcttc

引物共用序列

F: GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA

R: CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC

设计完成的序列

sgRNA1-F(PX458):

5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3

sgRNA2-R:

5- gaagacctaaacRMMMMMMMMMMMMMMMMMMFCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC -3

注1：这一对引物是以PX458/PX459为骨架载体，选择BbsI酶切位点（lentiguide和lenticrispr v2建议设计为BsmBI），同时正向引物需要加长;

注2：这种方法设计引物比较长，引物合成和后续PCR会有困难，也可以每条sgRNA设计两个短的引物进行巢式PCR。

3.3 PCR扩增序列

根据设计的两个靶点的引物，扩增插入序列

以pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep为模板扩增得到如下目的序列

4 中间gRNA表达盒与表达CAS9骨架载体的连接

本载体系统可采用2种策略进行Cas9载体和多个gRNA表达盒片段的一次连接组装： 

策略I：用Golden Gate cloning (ligation)方法 (Engler et al., 2008; 2009)；

策略II：是传统的酶切回收保存，酶切后的载体可以多次使用，片段单独酶切回收的方法。注：策略II载体单独回收保存，设计中间gRNA表达盒扩增引物时，可以自由选择实验室比较适宜的IIS限制性内切酶，不一定需要和载体同样的酶。

5 测序检测

构建成功之后的双sgRNA表达框如下

两个表达框中间设计有测序引物RVP3可以测序sgRNA2表达框，测序引物RVP4可以测序sgRNA1表达框。因两个表达框序列相识度比较高、结构复杂，可能会导致测序结果不好。如果骨架载体常用建议在骨架载体上重新选择引物测序，选距离两侧大于200bp远的位置设计测序引物。

附件

中间载体pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep介绍

1，pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep中插入的sgRNA表达框不是正常的结构，而是倒置的结构，不能单独使用，需要配合原有的sgRNA表达框（插入hU6- -gRNA scaffold之间）使用，才能形成（hU6- gRNA scaffold-hU6- gRNA scaffold）双表达框结构。

插入序列结构 BbsI-gRNA scaffold-测序引物-hU6启动子-BbsI

红色G是根据addgene部分构建好的质粒经验，在sgRNA的20个碱基之前，建议保留sgRNA插入红色G和gRNA scaffold之间。

插入序列中引入引物RVP3和RVP4作为测序引物，是荧光素酶报告基因质粒的常用引物，为防止和Cas9骨架质粒引物重复导致无法测序。为了压缩质粒大小（省钱），两个表达框之间没有插入太多碱基，尽管插入两个比较常用引物序列，结构复杂也有可能导致测序套峰或者中断的可能。如果测序不好建议在骨架质粒上设计引物测序

载体中sgRNA表达框两侧都加了BbsI酶切位点，在以pX458/pX459等酶切位点为BbsI为酶切位点的Cas9骨架载体时候，引物可以相对小一些。

5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3

2，为了不浪费的原则，我们构建载体的时候将这个sgRNA-U6的表达框插入到一个哺乳动物过表达载体中，切掉sgRNA-U6表达框就是一个完整的带有Twin-Strep-tag (Schmidt et al., 2013)的超小过表达空载体。sgRNA表达框两侧设计有两个XhoI酶切位点，用XhoI酶切之后回收自连即可。

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