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双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞)
发布时间:2019-12-10 14:41:45 | 浏览次数:


双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞)

上海海吉浩格生物科技有限公司


1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理图



2 相关载体图谱

2.1 中间载体 sgRNA载体(预设有BbsI酶切位点)

中间载体


2.2 CRISPR/Cas9骨架载体,表达CAS9,同时有完整的sgRNA表达框

 

含有CAS9的骨架载体

(骨架载体可以换成PX459PX461PX462lenticrispr V2lentiguide-puro或者其他同种gRNA scaffold的质粒)

  

3. 基因组靶位点选择和双链接头设计

3.1 靶位点选择

根据目的基因的物种在sgRNA设计网站上是设计靶点序列,根据需要选择特异性好的两个sgRNA靶点序列。

注(20nt靶点中FR是为了标记序列方向的碱基,F--R为正向,R--F为反向互补;NM都代表任意碱基,本文N20代表sgRNA1M20代表sgRNA2

 

对一个目的基因设计2个靶点。建议在ORF 5’区和功能结构域各设计1个靶点,使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失,或2个靶点之间的序列被敲除。


3.2引物设计

PCR产物核心公共序列

gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG


PCR扩增后的序列

GaagacaccaccG-FNNNNNNNNNNNNNNNNNNR-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG-FMMMMMMMMMMMMMMMMMMR-gtttaggtcttc

 

引物共用序列

F: GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA

R: CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC

设计完成的序列

sgRNA1-F(PX458):

5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3

sgRNA2-R:

5- gaagacctaaacRMMMMMMMMMMMMMMMMMMFCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC -3

1:这一对引物是以PX458/PX459为骨架载体,选择BbsI酶切位点(lentiguidelenticrispr v2建议设计为BsmBI),同时正向引物需要加长;

2:这种方法设计引物比较长,引物合成和后续PCR会有困难,也可以每条sgRNA设计两个短的引物进行巢式PCR


3.3 PCR扩增序列

根据设计的两个靶点的引物,扩增插入序列

pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep为模板扩增得到如下目的序列


4 中间gRNA表达盒与表达CAS9骨架载体连接

本载体系统可采用2种策略进行Cas9载体和多个gRNA表达盒片段的一次连接组装: 

策略I:Golden Gate cloning (ligation)方法 (Engler et al., 2008; 2009)

策略II:是传统的酶切回收保存,酶切后的载体可以多次使用,片段单独酶切回收的方法。注:策略II载体单独回收保存,设计中间gRNA表达盒扩增引物时,可以自由选择实验室比较适宜的IIS限制性内切酶,不一定需要和载体同样的酶。


5 测序检测

构建成功之后的双sgRNA表达框如下

两个表达框中间设计有测序引物RVP3可以测序sgRNA2表达框,测序引物RVP4可以测序sgRNA1表达框。因两个表达框序列相识度比较高、结构复杂,可能会导致测序结果不好。如果骨架载体常用建议在骨架载体上重新选择引物测序,选距离两侧大于200bp远的位置设计测序引物。


附件

中间载体pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep介绍

1pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep中插入的sgRNA表达框不是正常的结构,而是倒置的结构,不能单独使用,需要配合原有的sgRNA表达框(插入hU6- -gRNA scaffold之间)使用,才能形成(hU6- gRNA scaffold-hU6- gRNA scaffold)双表达框结构。

插入序列结构 BbsI-gRNA scaffold-测序引物-hU6启动子-BbsI

红色G是根据addgene部分构建好的质粒经验,在sgRNA20个碱基之前,建议保留sgRNA插入红色GgRNA scaffold之间。

插入序列中引入引物RVP3RVP4作为测序引物,是荧光素酶报告基因质粒的常用引物,为防止和Cas9骨架质粒引物重复导致无法测序。为了压缩质粒大小(省钱),两个表达框之间没有插入太多碱基,尽管插入两个比较常用引物序列,结构复杂也有可能导致测序套峰或者中断的可能。如果测序不好建议在骨架质粒上设计引物测序

载体中sgRNA表达框两侧都加了BbsI酶切位点,在以pX458/pX459等酶切位点为BbsI为酶切位点的Cas9骨架载体时候,引物可以相对小一些。

5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3


2为了不浪费的原则,我们构建载体的时候将这个sgRNA-U6的表达框插入到一个哺乳动物过表达载体中,切掉sgRNA-U6表达框就是一个完整的带有Twin-Strep-tag (Schmidt et al., 2013)的超小过表达空载体。sgRNA表达框两侧设计有两个XhoI酶切位点,用XhoI酶切之后回收自连即可。


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